肠神经病变是由肠神经系统异常引起的，发病率高，医疗费用高，但目前的治疗方法并不令人满意。细胞疗法提供了一种创新的方法来替代缺失或异常的肠神经元，从而恢复肠道功能。
从Wnt1-Cre;R26tdTomato小鼠胃肠道中分离肠神经干细胞(ENSCs)并生成神经球(NS)。NS移植通过注射到nNOS - / -小鼠(一种结肠运动障碍模型)的中结肠间质中进行，使用1次(n=12)或3次(n=12)注射(每次30 NS)，纵向间隔1 - 2 mm。6周后，通过肌电图(EMG)、电场刺激(EFS)、光遗传学和测量结肠直肠运动来评估功能结果。
移植的ENSCs在nNOS - / -受体结肠中形成氮能神经元。与单次注射相比，多次注射ENSCs可导致更大的覆盖面积，并与结肠功能的显着改善相关，这可以通过(1)肌电图记录显示结肠肌肉活动增加，(2)直肠珠排出更快，(3)体内粪便颗粒排出量增加来证明。器官浴研究揭示了通过光遗传刺激表达通道视紫红质的ENSCs直接进行神经肌肉交流，并恢复对EFS的平滑肌松弛。
这些结果表明，移植的ENSCs可以在结肠运动障碍模型中形成有效的神经肌肉连接并改善结肠运动功能，并且还揭示了多个部位的细胞递送可以改善反应，为优化临床试验设计铺平了道路。
肠神经病变由肠神经系统(ENS)异常引起，包括先天性神经节病(Hirschsprung病)、食管贲门失弛缓症、胃轻瘫、慢性假性肠梗阻和神经源性便秘等[1]。一般认为，功能性胃肠道(GI)疾病是主要的医疗负担，仅在美国每年的成本就超过250亿美元[2]，而肠道神经病变被认为是一个主要原因。尽管这些疾病的患病率和严重性，目前的治疗显示有限的疗效，往往不能解决潜在的病理生理。基于细胞的治疗代表了一种新的方法，通过替换缺失或损伤的肠道神经元，提供了直接治疗这些神经肠道疾病病因的潜力[3,4,5]。
肠神经干/祖细胞(ENSCs)可以从啮齿类动物[6,7,8,9]和人[10,11,12,13]的胃肠道中分离出来，也可以从人多能干细胞(PSCs)中提取[14,15,16,17,18]。在移植到出生后啮齿类动物的结肠后，ENSCs增殖、迁移并形成分化的胶质细胞和肠神经元簇[6,7]，包括神经元亚型，并与内源性ENS功能整合[8]。重要的是，通过将ENSCs移植到肠神经病变动物模型的结肠中，已经证明了结肠运动障碍的恢复[9]。psc来源的肠神经祖细胞提高了先天性巨结肠疾病模型的生存率，巨结肠疾病是一种最常见于婴儿的严重神经肠道疾病[17,18]。虽然这些结果证实了ENSC移植治疗肠内神经病变的潜力，但很少有研究直接表明移植的ENSC与受体结肠平滑肌之间存在功能性神经肌肉连通性。这种连通性对于引发改善肠道运动所需的收缩活动至关重要。
光遗传学是研究神经功能及其与目标器官(包括胃肠道)连通性的有力工具[8,19,20]。Stamp等人利用光遗传学选择性地刺激移植的ENSCs，并测量了受体结肠圆形平滑肌的细胞内记录，证明了移植物来源的神经元与肌肉功能整合[8]。虽然这提供了移植来源的神经元可以引发平滑肌动作电位的第一个证据，但它并没有证明ENSCs是否能够引发收缩肌肉活动。在离体移植后的离体肌肉条中也测量了结肠平滑肌的电活动，但在体内未测量完整器官的电活动。肌电活动是胃肠道神经肌肉活动的有用指标，已被用作胃肠道神经肌肉疾病的诊断工具，可能区分神经源性和肌源性病理[21]。在本研究中，我们将肌电图(EMG)活性和结肠直肠运动的体内测量与体外光遗传学和器官池研究相结合，全面表征了ENSC移植对缺乏神经性一氧化氮合酶(nNOS)的小鼠结肠的疗效，nNOS是一种肠道神经病变模型。我们的研究结果表明，细胞治疗能够在该模型中恢复结肠运动功能，为其在神经肠道疾病患者中的应用提供了坚实的基础。
本研究按照马萨诸塞州总医院机构动物护理和使用委员会审查并批准的方案进行(方案#2009N000239)。所有方法均按照相关指南和规定进行。手稿中的报告遵循了ARRIVE指南中的建议。
Wnt1::Cre小鼠(股票编号003829和股票编号009107)，R26R-tdT报告小鼠(股票编号007914)和R26R-ChR2tdT报告小鼠(股票编号012567)购自Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA)。将Wnt1::Cre小鼠与R26R-tdT和R26R-ChR2tdT报告小鼠杂交，分别产生Wnt1::Cre;R26-tdT(注释为Wnt1- tdt)和Wnt1::Cre;R26-ChR2tdT(注释为Wnt1- chr2)小鼠。
我们还通过将Plp1GFP;Wnt1::Cre小鼠与R26R-tdT小鼠杂交，制备了肠胶质细胞表达GFP的Plp1-GFP;Wnt1- tdt小鼠[22]，神经嵴源性ENS表达tdTomato。Plp1GFP小鼠[23]由科罗拉多大学丹佛分校的Wendy Macklin博士赠送。从Jackson实验室购买杂合子nNOS小鼠(股票号002986)，并进行繁殖以获得纯合子nNOS敲除小鼠(nNOS?/?)。
如先前报道的，从Wnt1-tdT、Wnt1-ChR2或Plp1-GFP;Wnt1-tdT小鼠中分离ENSCs[7,24]。简单地说，从2 - 3周龄Wnt1-tdT小鼠小肠中分离出带肌丛(myenteric plexus, LMMP)的纵肌层。用酶解酶(250 μg/mL)解离;Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)， 37°C, 40分钟。单个细胞通过40μm过滤器过滤分离，并在25 cm2的瓶中以50,000个细胞/mL的速度在小鼠增殖培养基中进行电泳，小鼠增殖培养基由NeuroCult小鼠基础培养基(StemCell Technologies)添加10% NeuroCult小鼠增殖补充剂(StemCell Technologies)， 20 ng/mL表皮生长因子(StemCell Technologies)和10 ng/mL基本成纤维细胞生长因子(StemCell Technologies)组成。7天后，获得原代神经球，用于移植实验。
如前所述，对受体小鼠结肠进行免疫组织化学处理[7,22]。整体制备的LMMP和肠内神经球在4%多聚甲醛中固定。用0.1% Triton X-100渗透整块lmpp或神经球制剂，并用10%驴血清阻断。一抗在10%的驴血清中稀释，包括山羊抗gfap (1:20 00, Abcam, ab53554)、人抗huc /D (Anna1, 1:16 000, Lennon实验室赠送)小鼠抗huc /D (1:50, Invitrogen, A-21271)、兔抗nnos (1:100, Cell Signaling, C7D7)、兔抗sox10 (1:40 00, Abcam, ab155279)和小鼠抗神经元III类偶联β-微管蛋白(Tuj1;1:400;科文斯，戴德姆，美国)。二抗包括抗兔IgG (1:500;Alexa Fluor 488;Fisher Scientific Life Technologies)和抗人IgG (1:20 00, Alexa Fluor 594;Fisher Scientific Life Technologies)。细胞核用DAPI (Vector Labs, Burlingame, CA)染色，用aqua-poly/mount (Fisher Scientific Polysciences Inc.)载片。使用尼康A1R激光扫描共聚焦显微镜(Nikon Instruments, Melville, NY)或Keyence BZX-700 All-In-One显微镜系统(Keyence America, Itasca, IL)拍摄图像。
8 ~ 12周龄小鼠作为受体小鼠进行移植研究。用异氟醚吸入麻醉小鼠。腹部皮肤中线切开，暴露中结肠。细胞悬液的浓度为每μL 10个神经球或每μL 30个神经球，每个部位注射3 μL，结果见表1。3 μ l细胞悬液沿中结肠前壁2 mm长度分布(图1B)。对于三次注射，注射部位沿结肠的反肠系膜侧纵向定向(图1B’)。细胞注射后，用墨汁在部位纹身，以备以后识别(图1B’)。
表1本研究各实验组
图1
多次向nNOS - / -小鼠结肠注射ENSCs可增加细胞覆盖率。ENSCs的免疫组织化学表征(A)及其在体内移植到小鼠中结肠(B)。细胞注射后6周，采用全量制备法测量移植的ENSCs覆盖面积(C)。多次注射的覆盖面积明显大于单次注射(D， *p < 0.05)。比例尺50μm (A ' -A '″)和1 mm (B和C)
通过测量直肠珠排出时间、计数粪便颗粒排出数量和肌电图来评估细胞移植后胃肠道运动的功能结果。
1.
直肠珠排出(RBE)时间使用硅胶推进器将直径为3mm的玻璃珠插入远端结肠1cm处，确定珠排出时间，时间限制为100 min[25]。
2.
粪便颗粒输出(FPO)在开始分析前，将一只小鼠单独饲养在不加垫料的笼子中30分钟。动物们可以自由获取食物和水。每隔30 min收集一次排出的粪球，计算2 h内排出的粪球总数[19,26]。
3.
体内电生理电生理指标被用来评估细胞移植方法的有效性。在RHS刺激/记录系统(Intan Technologies)上以30 khz采样频率进行Luminal录音。所有程序均在马萨诸塞州总医院(MGH)机构审查委员会(IRB)的批准下进行。用1-5%异氟醚麻醉雌雄小鼠及其野生型对照组(Jackson Laboratory, Maine, USA)。肛门扩张后，使用2-4 mL生理盐水进行灌肠。将四到六个均匀间隔的双极电极放置在连接32针头(Omnetics)的定制探针上，插入远端结肠，并记录至少20分钟的电活动。安乐死后，进行剖腹手术，检查组织是否穿孔并检查电极的正确放置。
在收集体内数据后，使用先前描述的标准器官浴技术进一步分析结肠平滑肌的离体功能[22]。将刚切除的远端结肠迅速置于含有生理克雷伯氏溶液(118 mmol/L NaCl、4.7 mmol/L KCl、1.2 mmol/L MgSO4·7H2O、1.2 mmol/L KH2PO4、25 mmol/L NaHCO3、11.7 mmol/L葡萄糖和1.25 mmol/L CaCl2，所有化学物质均来自Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)的培养皿中。用印度墨水标记结肠段，切成5毫米环状。然后将结肠环安装在两个小金属挂钩之间，挂钩连接到肌肉条形肌图浴中的力位移传感器(820 MS型;丹麦Myo科技公司，奥胡斯，丹麦)，含7ml生理克雷布斯溶液(95% O2和5% CO2充氧)，保持在37°C。然后，将环拉伸至0.5 g的基础张力，并在每20分钟更换一次的Krebs溶液中平衡60分钟。使用Power Lab 16/35数据采集系统(ADInstruments, NSW, Australia)和使用Lab Chart Pro Software v8.1.16 (ADInstruments)的计算机记录和分析圆形平滑肌的力收缩。电场刺激(EFS)通过连接到CS4恒压刺激器(丹麦Myo Technology，丹麦奥胡斯)的刺激电极(内置于室盖内)施加。结肠段刺激15 s，刺激频率(5 Hz)、电压(40 ~ 60 V)、脉冲持续时间(300 μs)由myoppulse软件(Danish Myo Technology, Aarhus, Denmark)控制。在非肾上腺素能非胆碱能条件下(阿托品;盐酸酚妥拉明1 mM;盐酸心得安1 mM;1毫米)。在使用一氧化氮合酶拮抗剂前5分钟和后5分钟分别应用EFS，在浴液中加入L-NAME (100 mM)以检测氮能介导的反应。通过在EFS前5分钟平均60秒的数据获得基线值，反弹收缩(ii期)的最大变化以基线值的绝对变化或百分比变化表示。曲线下面积(AUC)，减去基线，在EFS期间的前10秒被确定为第一阶段(松弛)。为了评估组织的活力和确认组织的功能，在每次实验开始和结束时进行60毫米氯化钾的收缩反应并进行比较。
受体结肠段按上述方法制备。蓝光刺激(BLS)采用二极管泵浦固体激光系统(470 nm, 200 mW，型号:MDL-III-470;OptoEngine, LLC, Midvale, UT)。通过直径为200 μm的玻璃光纤，将脉冲序列(脉冲宽度为20 ms，脉冲频率为10 Hz，脉冲持续时间为15 s)聚焦照射到移植结肠的浆膜表面。
从Intan系统中导出数据并在MATLAB中进行处理。数据经过带通和陷波滤波(60 Hz)以去除低频运动伪影、呼吸伪影和白噪声。在平均整流信号的基础上进一步对数据进行整流和归一化。收缩速率由单位时间内出现的峰值数量来定义。手动选择数据的休眠部分来表示基线休息状态。该数据的平均值被指定为基线静息振幅。峰值被定义为至少比基线静息幅度大1.5倍的峰值簇，并且距离最近的邻居至少10毫秒，以防止重复计算相同的峰值。
使用GraphPad Prism v8 (GraphPad Software, Inc.， San Diego, CA)进行数据分析。两两比较采用双尾t检验。采用事后Holm-Sidak检验对多重比较进行单因素方差分析(ANOVA)。对于所有的分析，p < 0.05被认为是显著的。除非另有说明，所有数据均以平均值±SEM表示。
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分离小鼠ENSCs并在培养中扩增形成神经球(NS)(图1A-A″″)。免疫组织化学表征证实存在表达sox10的神经祖细胞(图1A’)、HuC/D +神经元(图1A″)和GFAP +胶质细胞(图1A’″)。将3个月大的nNOS - / -小鼠中结肠前壁微注射3 ul NS悬液(n=12，图1B，虚线圈)。细胞注射分为三组(表1):第一组(30 NS × 1注射部位，n=12，图1B);第2组(30个NS × 3注射点沿抗肠系膜结肠纵向定位，n=12，图1B’);第三组(90 NS × 1注射部位，n=5)。注射部位用印度墨水纹身，以便以后识别(图1B’)。细胞移植6周后，受体结肠的全量制备显示移植的ENSCs成功植入(图1C，箭头)。与单次注射相比，三次注射组移植的ensc来源的细胞和纤维覆盖的面积明显更大(图1C’和D;(2.01±0.55 mm2 vs. 0.84±0.29 mm2, n=3, p < 0.05)，而每次注射覆盖的面积无显著差异(图1D ')。
从受体nNOS - / -小鼠结肠中获得的全量制备的免疫组织化学检查显示，移植的Wnt1-tdT +细胞与胶质标记物Plp1共表达(图2A，放大图2A ')。神经标记物Tuj1染色(图2B - b″)显示移植的Wnt1-tdT +细胞出现神经元分化(图2B '″，箭头)。从移植细胞延伸出来的神经元纤维似乎与粘膜下层内的宿主内源性神经元纤维结合(图2C-C″″)。此外，Wnt1-tdT +移植细胞亚群对nNOS具有免疫反应(图2D-D″″，箭头)，表明它们分化为氮能神经元，这在受体nNOS缺陷结肠中缺失。
图2
ENSCs在体内移植到小鼠结肠6周后产生胶质细胞和神经元，包括表达nnos的亚型。移植的ENSCs被鉴定为tdT +细胞和纤维，与肌层的胶质标记物Plp1共定位(A)，而来自移植细胞的一些突出纤维为Plp1阴性(A '，虚线框放大图，如图A所示)。用Tuj1进行全免疫染色(B ' B '″)显示移植ENSCs的神经元分化(B '″，箭头，B '″是虚线框放大图，如图B所示)。在粘膜层(C-C″)，移植的ensc衍生的神经元纤维与宿主神经元结合(C '″为C″虚线框放大图)。ensc衍生的神经元亚群表达nNOS (D - D″″，箭头，D '″是D中虚线框的放大图)。比例尺1 mm (A)和200μm (B-D)
细胞移植后6周评估受体小鼠的结肠功能。已知缺乏nnos的小鼠存在上、下消化道运动障碍[9,27]。然而，在细胞治疗后，我们观察到结肠直肠运动的显著改善。与接受假手术的WT窝仔相比，nNOS - / - Sham组的直肠珠排出时间更长(图3A, p=0.055)。三次注射30 NS的细胞移植显著减少了nNOS?/?小鼠的直肠珠排出时间(图3A, KO (Sham) vs KO (30 NS × 3)， *p < 0.05)。相比之下，单次注射30 NS并没有改善排烟时间(图3A)。我们检查了在2小时内排出的粪便颗粒的数量来评估结肠直肠的运动。与WT Sham组相比，假手术nNOS - / -小鼠排出的微球明显减少(图3B, WT (Sham) vs. KO (Sham)， *p < 0.05)， ENSC移植恢复了这种表型(图3B, KO (Sham) vs. KO (30 NS × 3)， **p < 0.01;KO (Sham) vs. KO (30 NS × 1)， *p < 0.05)。
图3
多次注射ENSCs可在体内部分恢复nNOS - / -小鼠结肠直肠运动障碍。多次注射ENSCs后，假手术nNOS?/?(KO)小鼠的直肠珠排出时间延迟正常化[A KO (Sham) vs KO (30NS × 3)， *p < 0.05]，但单次注射不正常。假手术KO的粪便颗粒排出量显著降低(B *p < 0.05)，而注射ENSCs恢复了这种表型[B KO(假手术)vs KO (30NS × 3)， **p < 0.01;KO (Sham) vs. KO (30NS × 1)， *p < 0.05。活体肌电图显示，与假手术WT相比，假手术KO的结肠平滑肌活动显著降低[C WT (Sham) vs. KO (Sham)， *p < 0.05]，而多次注射ENSCs可显著改善肌肉活动[C KO (Sham) vs. KO (30NS × 3)， **p < 0.01]。
根据肌电图(EMG)记录，KO小鼠的收缩率(以每分钟爆发簇的数量来定义)明显低于WT。采用周期刺激法，在全身麻醉动物体内观察结肠对10 Hz、50 μA、3次10 μs脉冲(90 s)的兴奋反应。在这些条件下，KO组的收缩率明显低于WT(图3C, WT (Sham) vs. KO (Sham)， *p < 0.05)。三次注射的细胞移植导致KO小鼠的收缩率显著增加(图3C, KO (Sham)与KO (30 NS × 3)， **p < 0.01)，再次证实ensc介导的nNOS - / -小鼠结肠运动恢复。最后，为了确定这些作用是来自注射次数的增加还是来自给药细胞数量的增加，我们通过单次注射向nNOS - / -小鼠的结肠中注入90 NS(图3A-C中为90 NS × 1)。然而，通过测量的任何参数，这并没有改善结肠运动(图3A-C)。因此，进一步的实验没有包括单次注射90 NS的测试。
为了确定ENSC移植是否可以恢复nnos缺陷小鼠的氮能反应，进行了器官浴研究。在非肾上腺素能-非胆碱能(NANC)条件下，电场刺激(EFS)诱导WT小鼠结肠平滑肌长时间松弛(图4A, WT(假手术)，第一阶段)，随后刺激后反弹收缩(图4A, WT(假手术)，第二阶段)。相比之下，从nNOS - / -小鼠获得的平滑肌在对EFS的反应中没有表现出肌肉松弛(图4A, KO (Sham)，第一阶段)和刺激后的过度反弹收缩(图4A, KO (Sham)，第二阶段)。ENSC移植6周后，nNOS - / -小鼠表现出抑制反应的恢复(图4A, KO (30 NS × 3)和KO (30 NS × 1)，第一阶段)。ENSC移植修复了nNOS - / -平滑肌松弛缺失(图4B, WT (Sham)为- 0.18±0.05 g s, KO (Sham)为0.05±0.02 g s， **p < 0.01)(图4B, KO (Sham)为0.05±0.02 g s, KO (30 NS × 3)为- 0.07±0.03 g s, KO (30 NS × 1)为- 0.05±0.01，**p < 0.01)。此外，nNOS?/?小鼠刺激后的过度收缩(图4C, WT (Sham) 0.44±0.06 g, KO (Sham) 0.93±0.10 g， **p < 0.01)被ENSC移植消除(图4C, KO (30 NS × 3) 0.39±0.03 g, KO (30 NS × 1) 0.41±0.05 g， **p < 0.01)。
图4
ENSC移植恢复nNOS?/?(KO)结肠循环平滑肌活动。在NANC条件下对EFS的机械响应的代表性痕迹。EFS诱导的双相反应表现为弛豫(第一阶段)和反弹收缩(第二阶段)。B和C efs诱导的松弛(曲线下面积)和反弹收缩(最大效应显示为与基础值的绝对变化)的量化。D组和E组数据说明了L-NAME对efs诱导的移植小鼠肌肉活动的影响。误差条表示平均值±SEM。动物的数目在括号内。***p < 0.001， **p < 0.01， *p < 0.05
为了证实松弛反应的恢复是由于移植的ensc衍生的氮能神经元，在NANC条件下，在一氧化氮合酶(NOS)阻断剂L-NAME存在和不存在的情况下进行了EFS。L-NAME显著降低了三次注射后efs诱导的松弛26% (p < 0.001, n=5)和一次注射后28% (p < 0.05, n=5)(图4D)。同样，L-NAME后刺激后反弹收缩分别显著增加15% (p < 0.001, n=5)和26% (p < 0.001, n=5)(图4E)，证实这些作用是由一氧化氮介导的。
为了确认efs诱导的反应是否直接归因于移植源性细胞的神经元激活，我们从3周龄的Wnt1::Cre;R26-ChR2 (Wnt1-ChR2)小鼠中分离出ENSCs，其中所有神经嵴源性细胞都表达光敏离子通道，通道视紫红质-2 (ChR2)，并将这些细胞移植到nNOS - / -小鼠结肠中。假手术包括移植从Wnt1-tdT (chr2阴性)小鼠中分离的ENSCs。三周后，摘取移植部位，进行器官浴研究。nNOS?/?小鼠的结肠平滑肌在蓝光刺激(BLS)下没有表现出松弛、静止或反弹收缩(图5A, Sham)。相比之下，在接受Wnt1-ChR2细胞的结肠中，BLS诱导了松弛反应，随后是反弹收缩(图5A '， ChR2NS和图5A″，a '中所示蓝框的放大视图)。定量比较显示，小鼠的抑制反应(图5B, Sham组为0.07±0.02 g s, ChR2 NS组为- 0.36±0.10 g s， *p < 0.05)和兴奋反应(图5C, Sham组为0.07±0.05 g, ChR NS组为1.62±0.17 g， **p < 0.01)。这些结果表明，移植神经元的激活产生可测量的肌肉活动，证实了移植的ENSCs有效的神经肌肉连接。
图5
通过移植ENSC-ChR2细胞恢复nNOS?/?小鼠结肠循环平滑肌活动。A-A″结肠平滑肌对BLS机械反应的代表性痕迹。假手术的nNOS?/?结肠对BLS A没有反应，而BLS诱导的双相反应以ChR2 NS移植小鼠的初始松弛和反弹收缩为特征(A ' -A″，A″是A '中所示蓝框的放大视图)。B和C量化bls诱导的松弛(曲线下面积)和反弹收缩(最大影响显示为与基础值的绝对变化)。误差条表示平均值±SEM。动物的数目在括号内。**p < 0.01， *p < 0.05
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