从赤铜菌中提取氢化酶的研究已经进行了二十多年，至今仍采用常见的培养接种方法。这些方法从未适应改良菌株的要求，导致细菌在预培养中的生理状态不同，从而导致延长和不同的滞后期。

　　为了获得均匀且始终同样适合接种的预培养物，本研究建立了C. necator HF210衍生物(C. necator HP80)的预培养优化方案，用于同源过表达NAD+还原可溶性氢化酶(SH)基因。我们比较了不同培养基的预培养生长，确定了最佳的收获时间。本研究中获得的方案是基于随后的两次预培养，第一次是在复合营养液培养基(NB)中，第二次是在果糖-氮无机盐培养基(FN)中。

　　尽管随后进行了两次预培养，但我们的方案将预培养时间减少到30小时以下，并为C. necator HP80的培养提供了可重复的预培养。

　　Cupriavidus necator(原Ralstonia eutropha)除了是聚羟基烷烃酸盐的主要生产者外，还成为利用H2和CO2进行石养生长的模式生物(Burgdorf et al. 2005;Lenz et al. 2002;Schwartz et al. 2009)，以及它生产聚羟基丁酸酯(PHB)的能力(Budde et al. 2010;Riedel et al. 2012)及其耐氧氢化酶(Lenz et al. 2002;Poladyan等人，2019;Sch?fer et al. 2016)是当前研究的重点。特别是，能量转化氢化酶是特别感兴趣的。它们参与H2氧化，因此使它们成为H2驱动生物转化的有希望的候选者，例如作为辅助因子再生系统的一部分，生物传感器，或作为生物燃料电池的生物阳极(Burgdorf等人，2005;judge等人，2016b;Lauterbach and Lenz 2013, 2019;Lenz et al. 2015;Lu et al. 2016;Schneider and Schlegel 1976)。因此，寻找节省时间和成本的生物技术方法来高产地生产这些氢化酶是很重要的。到目前为止，已经使用了不同的方法从C. necator中获得NAD+还原活性可溶性氢化酶(SH)，然而，实验只在实验室规模达到5 L的体积下进行(Jugder等人，2016b;Lauterbach and Lenz 2013;Lenz et al. 2018)。为了节省时间和成本并在工业规模上应用，重要的是建立一个可复制的标准来获得导致主培养物快速生长的前培养物，这最终导致大量的SH。

　　近50年来，绿僵菌的标准栽培方法没有太大变化。因此，预培养的标准方法是将琼脂板上的新鲜转化体接种到液态果糖-氮培养基(FN)中(Kleihues et al. 2000;Schlegel et al. 1961)。多年来，只有使用过的培养基在成分上进行了修改，例如，为了异养生长而添加果糖(Lenz et al. 1994;Sch?fer et al. 2013)。从一开始，预培养物在30°C孵育，但在此期间，37°C反复选择孵育温度(Al-Shameri 2020;小跟班2014;Poladyan等人，2019;Wilkening 2021)。孵育时间也不断变化;常见的预培养要么作为过夜培养进行(Jugder等人，2016b)，要么培养长达48小时(Goris 2011;小跟班2014;Sch?fer et al. 2013)。在某些情况下，在固定后期进行预培养接种，没有指定具体时间(Lenz et al. 2018)。同时，越来越多的报道使用甘油原液接种预培养物(Al-Shameri 2020;Sydow et al. 2017;Wilkening 2021)。同样，接种的固定体积(例如，预培养到主培养的1:20)(Jugder等人，2016a)和最终体积的固定OD436 (Kohlmann 2015;Wilkening 2021)。为了覆盖大量适合细胞接种较大主培养物的方面，使用了两种预培养物(Wilkening 2021)。在其他生物的培养中也发现了这一点，例如铜毒杆菌(Herzberg etal . 2015;Wiesemann et al. 2017)。2013年，Schiffels已经指出，史前文化的条件被认为是可重复性的关键(Schiffels 2013)。尽管每次培养都从预培养开始，而最佳的预培养管理是可持续过程绩效的先决条件，但到目前为止，预培养条件尚未得到详细研究，也不是每个出版物都详细介绍了预培养的准备工作。当应用这些方案中的任何一种时，使用不确定大小的新鲜菌落接种预培养物或预培养物生长一段特定时间，例如过夜或48小时(Kohlmann 2015;Lu et al. 2016;Poladyan等人，2019;Sch?fer et al. 2016)，不控制培养生长，导致前培养细胞的生理状态不同，从而导致主要培养物的可重复性很差，滞后期、蛋白质产量和活性不同。

　　因此，由于缺乏统一的史前文化的具体协议，我们已经着手开发一个，基于一些现有的方法。在这项工作中，我们建立了一个统一的、可重复的预培养方案，使用两种预培养，从定义的冷冻库接种，温度为30°C，从复杂培养基切换到最小培养基。

　　C. necator HP80 (pGE771) (Lauterbach and Lenz 2013)在含有3 g肉提取物1?1和5 g明胶1?1蛋白胨的营养液培养基(NB)或含有25 mM Na2HPO4 × 12 H2O、11 mM KH2PO4、0.8 mM MgSO4 × 7 H2O、0.06 mM CaCl2 × 2 H2O、0.01 mM FeCl3 × 6 H2O、0.001 mM NiCl2 × 6 H2O、37 mM NH4Cl和4 g果糖1?1的果糖氮培养基(FN)中生长。果糖-甘油-氮培养基(FGN)的组成方式与FN培养基相同，但含有2g果糖和甘油1 - 1的混合物。

　　培养物在100ml Erlenmeyer烧瓶中最终体积为10ml培养基或125ml超产量烧瓶中最终体积为25ml培养基，在30°C的氧气条件下在轨道摇床上生长(瑞士Infors HT)。选用15μg四环素ml?1。光密度用分光光度计(Ultrospec 2100, Amersham biosciences)测定，波长为436 nm (OD436)。

　　C. necator HP80的甘油原液制备方法如下:细胞在100ml Erlenmeyer烧瓶中加入10ml NB培养基培养至指数生长晚期。用NB培养基将培养液调至OD436: 2.8，加入等量的50%无菌甘油，加至40μl，速冻保存于-80℃备用。接种10 ml NB预培养液时，使用冷冻液40μl。

　　摘要。

　　介绍

　　材料与方法

　　结果与讨论

　　结论

　　数据可用性

　　参考文献。

　　致谢。

　　作者信息

　　道德声明

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　　高效、稳健的生物工艺的开发已经从主要工艺的预培养开始。预培养不仅要具有可重复性，而且要在尽可能短的时间内提供足够的重要细胞材料，使主培养物能够快速生长，没有长滞后期，以确保生产的成本效益。在这方面最关键的是细胞从甘油原液转移到预培养物和从预培养物转移到主培养物后的适应时间。

　　我们测试了三种不同的培养基作为前培养物的适用性。一方面是原计划用于主培养的FN和FGN无机盐培养基，另一方面是已经用于生产冷冻液的NB。为了确保培养物的可重复性，所有的培养都是从标准化的冷冻培养基开始的(见材料和方法)。将10 ml NB、FN或FGN培养基中的预培养物分别从冷冻液中取出40μL接种于100 ml摇瓶中，在30°C下剧烈摇培养18 h。每隔1至2小时取一次样品，以跟踪光密度增加(OD436)的生长情况(图1)。FN和FGN无矿盐培养基培养在18小时后几乎没有生长，最终ODs分别仅为0.03和0.04。这可能是由于培养物对这些培养基的适应缓慢，分别表现为12和15小时的极长滞后期(图1)。相比之下，在NB培养基中，大约3-4小时后开始指数生长，大约16小时后达到固定阶段(图1)。NB培养基中的复杂添加剂使细胞能够更快地从冷冻培养基适应液体培养的条件。因此，选择NB培养液接种第二次预培养，而不是在FN或FGN中长时间培养。

　　图1

　　

　　C. necator HP80在不同培养基上的生长。预培养物接种40μl冷冻液，每种培养基各10 ml。测量OD436在NB培养基(绿色菱形)、FN培养基(红色三角形)和FGN培养基(蓝色正方形)中记录的生长曲线。箭头表示接种第二次预培养的时间点

　　选择三个时间点，在NB预培养物的FN或FGN无机盐培养基中接种第二预培养物。这些时间点对应于12 h后的指数生长期，预期OD436约为1,15 h后的指数后期，预期OD436为2,18 h后的早期平稳期，预期OD为2.5。在不同的时间点取样，测量OD436的生长情况(图2)。

　　图2

　　

　　C. necator HP80在第一次NB预培养的FN (a)和FGN培养基(b)中的生长。细胞分别处于指数生长期(绿色菱形)、指数晚期(红色三角形)和稳定期(蓝色正方形)。在30°C下，以250 rpm的转速振荡，记录细胞生长超过30 h。所有培养均为三次。箭头表示接种主培养物的时间点

　　所有培养都显示出相当的生长，并达到相似的OD436最大值，约为。与第一次预培养时间无关，FN培养基中分别为9个，FGN培养基中分别为5个。然而，第一次前文化的延长导致了第二次前文化的缓慢增长。从12小时预培养中接种的培养物在FGN和FN培养基中分别在15和18小时后达到稳定期，而从15或18小时预培养中接种的培养物在FGN和FN培养基中分别需要3和6小时才能达到稳定期(图2)。较慢的生长可归因于细胞适应度降低，导致使用较旧的预培养物时延迟期延长。因此，在NB培养基上接种第一次预培养12 h后，在FN培养基上进行第二次预培养是最佳的。

　　第一次和第二次史前文化的制备方法如上所述。14h、17h、20h后，从第二次预培养液中接种25ml主培养液，置于125ml超产瓶中，用分光光度计测量OD436，记录其生长曲线(图3)。

　　图3

　　

　　C. necator的主要培养物在25ml FGN培养基中生长，在125ml挡板摇瓶中。分别在FN培养基中培养14 h(绿色菱形)、17 h(红色三角形)和20 h(蓝色正方形)，接种到OD436为0.1的培养基中。通过测量OD436来检测生长。所有培养均为三次

　　预培养14 h和17 h接种的两种培养物生长速度几乎相同，且略快于预培养20 h接种的两种培养物，其生长速度μ为0.23 h?1、0.23 h?1和0.22 h?1。培养15h后，两种培养物均在OD值约为4时达到稳定期。此时，从预培养20 h开始的培养仅达到其他两种培养的OD436的一半左右，仅在18 h后达到固定阶段，OD436为4。对于主培养的接种，确定在14 ~ 17 h之间进行第二次预培养，以获得主培养的快速高生长。

　　因此，在NB培养基中进行12 h的第一次预培养，然后在FN培养基中进行14 h的第二次预培养，发现FN培养基对主培养的快速和可重复性生长是最佳的。用指数生长的细胞接种主培养物更有利，因为对新鲜培养基的适应更容易和更快。相反，从静止期后期接种的细胞往往对主培养物的后续生长产生负面影响，其特征是延迟期延长。与细胞培养48小时的单一预培养系统相比(crsampin et al. 2016;Wilkening 2021)，或者直到达到后期的固定阶段(Lenz et al. 2018)，由于两个关键适应步骤的解耦，即从低温培养基到生长的液体培养基的过渡以及从复杂培养基到矿物盐培养基的过渡，双预培养系统允许更快的生长。

　　目前的工作解决了生物过程发展的一个重要方面，即培养前管理，这经常被忽视或低估，但对于成功和经济的过程设计仍然很重要。根据我们的结果，我们提出了两阶段的预培养是最优的(图4)。

　　图4

　　

　　预培养过程优化方案。将C. necator在10ml NB培养基中培养至2.8的OD436，并将培养物与50%无菌甘油1:1混合，制备冷冻液。第一次预培养用40μl冷冻液接种于10%填充NB培养基的摇瓶中，在30°C和250 rpm摇瓶中培养12 h。然后将第一次预培养物在摇瓶中10%填充的情况下接种到od4360.1，在30℃、250 rpm摇瓶下培养14 ~ 17 h

　　单阶段预培养的主要困难在于，细胞生理上的关键转变必须同时发生，即从冷冻培养基或琼脂平板转变为液体培养，从复杂培养基转变为主要培养中使用的无机盐培养基。这两种变化都需要细胞生理学的适应，并伴有或多或少的长时间生长停滞，其表现为延长的滞后期。当使用两个预培养方案时，这个问题不再明显。将所需的两个适应解耦是有利的，因为它允许更快地适应细胞生理，从而将总体预培养时间减少到30小时以下。此外，使用对数相细胞接种主培养物的可能性几乎消除了主培养物中的滞后期，从而进一步减少了整个过程持续时间，这有利于过程经济。此外，单个培养物的生长差异几乎可以忽略不计，这表明我们的方案具有很高的可重复性，从而可以准确预测接种主培养物所需的时间和培养量，从而节省额外的资源，例如反应器体积和培养基。

　　随着人们对可替代绿色能源的需求日益增长，氢化酶将越来越成为研究的重点。与此同时，必须改进氢化酶的生物技术生产，以便使这些酶在工业规模上有足够数量的成本效益应用。这里提出的前文化管理可能是对这一过程发展的第一个贡献。

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